طراحی و ساخت وکتور پلاستیدی حاوی ژن stxb شیگلا دیسانتری تیپi برای گیاه کاهو

پلاستیدها اندامکهای گیاهی همراه با kb 120-150 ژنوم و تعداد 1،000-10،000 نسخه در هر سلول می باشند. کلروپلاست اندامک محوری و شناخته شده در سلول های گیاهی و جلبک های یوکاریوتی است و امکان انجام فتوسنتز را ، فراهم می کند که منبع اولیه غذایی در جهان محسوب می شود، انتقال ژن های خارجی به کلروپلاست گیاهان دارای مزایای زیادی است که می توان به بیان بالا و پایدار پروتئین های خارجی و عدم آلودگی زیست محیطی اشاره کرد، همچنین سکوت ژنی در پلاستیدها گزارش نشده است. کلروپلاست گیاهان یک میزبان مناسب برای بیان ژن های خارجی می باشد. با توجه به طراحی نقاط همولوژی در ناقل اختصاصی گیاه مورد نظر جهت نوترکیبی در ژنوم کلروپلاست، ژنهای خارجی را به ژنوم ها منتقل می کنند. برای بیان بیشتر ژن از قطعات اختصاصی تشدید کننده بیان ژن و جهت بالا بردن میزان نوترکیبی از ژن های reca می توان استفاده کرد، که در طراحی و تهیه ناقل، آنها را مد نظر قرار می دهند. در طراحی وکتور پلاستیدی دو جایگاه دارای همولوژی کامل با کلروپلاست لازم و ضروری است که از 14 جایگاه دوتایی استفاده می نمایند. شیگلا دیسانتری به عنوان علت اصلی اپیدمی اسهال، در صد سال اخیر گزارش شده است. شیگلوز یک بیماری عفونی است که توسط شیگلا ایجاد می شود. بیشتر علائم عفونی شیگلوز شامل اسهال، تب، حالت تهوع، استفراغ، درد شکمی، خون و مخاط یا چرک در مدفوع می باشد. محل اصلی هجوم شیگلاها و ضایعات ایجاد شده در انتهای روده کوچک و سرتاسر کولون است. باکتری پس از رشد، توکسینی تولید می کند که به سلول های اپیتلیال روده حمله و سبب اسهال خونی می شود. که عامل آن آنتروتوکسین شیگلا می باشد. انتروتوکسین شیگلا shigella toxin (st) سالیان زیادی است که شیگا توکسین یا stx بعنوان یکی از عوامل ویرولانس شیگلا دیسانتری در ایجاد اسهال خونی ودسانتری مطرح است. شیگا توکسین ها خانواده ای از سموم دو زیر واحدی ab را تشکیل می دهند . توکسین شیگا stx یک پروتئین هگزامر با وزن مولکولی 70.5 kda کیلودالتون بوده که از یک زیرواحد منومریک سمی و آنزیماتیک به نام stxa و از یک زیرواحد متصل شونده به رسپتور هموپنتامریک به نام stxb تشکیل شده است. قسمت غیر سمی stxb برای ورود و عملکرد قسمت سمی یا stxa ضروری می باشد. ناحیه stxa دارای وزن مولکولی در حدود 32 kda کیلو دالتون بوده که خود از دو قطعه که با پیوند کووالانس به هم متصل شده اند: قطعه اول a1 نام دارد که وزن آن در حدود 28 kda بوده و قطعه دوم بنام a2 دارای وزنی در حدود 4 kda می باشد. ناحیه انتهایی c از قطعه a2 ) c ترمینال a2 ( مسئول برهمکنش زیر واحد stxa با قسمت stxb این توکسین می باشد. قسمت a1 از stxa ناحیه سمی و آنزیماتیک محسوب می شود و سبب مهار سنتز پروتین می گردد. stxb ساختار هموپنتامریک ( 5 زیر واحد ) دارد که از 5 utr منومر کاملا یکسان تشکیل شده است. این ناحیه به کمک قسمت c ترمینال a2 به قسمت stxa با پیوند غیرکووالان متصل می گردد، و باعث ورود این ناحیه به درون سلول می شود. stxb به گیرنده سطح سلولی خود به نام gb3 متصل می گردد که روی اکثر سلولهای بدن بیان می شود. ورود شیگا توکسین به درون سلول میزبان از طریق مکانیسمretrograde system صورت می گیرد. ناحیه a1 از قسمت stxa قسمت سمی محسوب می شود.stxa1 باعث دپورینه شدن آدنوزین در 28s rrna در زیر واحد 60s ریبوزوم می گردد. این تغییر در ریبوزوم باعث می شود که trna نتواند به کمپلکس پروتئین سازی متصل شود و در نتیجه پروتئین سازی در سلول هدف مهار می گردد. با عدم اتصال آن به ریبوزوم یک سری از پروتئین کیناز ها مثل (jun-n terminal kinase) jnk و پروتئین کیناز فعال کننده میتوژن p38 (mapk) فعال می شود که خود منجر به تغییرات در مسیر پیام رسانی در کیناز های تنظیم کننده ای مثل (extracellular signal regulated kinase)erk-1 ,2 می گردد که در نهایت بسته به نوع سلول هدف میتوژن و سایتوکاین های مختلفی تولید می گردد که در فعالیت های مختلفی از سلول تاثیر می گذارد. نکته مهم در فعالیت آنزیماتیک قسمت a1 تجزیه پروتئولیتیکی در باند های دی سولفیدی a1-a2 است که در دستگاه گلژی رخ می دهد. در واقع stxa یک n galactosidase است که با اثر بر 28srrna ریبوزم، سنتز پروتئین را در ریبوزوم مهار می کند. در این مطالعه با بررسی اثرات مهلک سم شیگلا یا شیگا توکسین در ایجاد سندروم اورمیک و اسهال خونی کشنده و شایع بودن آن در اکثر آلودگی ها و با توجه به امکان استفاده از آن در جنگ های بیولوژیک و استفاده های نامتعارف از سوی بشر، طراحی و ساخت وکتور پلاستیدی حاوی ژن stxb همراه با ژن ctbبه منظور تقویت پاسخ ایمنی علیه stxb جهت انتقال به کلروپلاست گیاه کاهو علیه stxb وسم stxa انجام شد.